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PCR产物和质粒双酶切后电泳如何判断酶切完成?

日期:2020-01-23 23:35

  2、如果是克隆,连接T载体后不用酶切,直接转化菌落pcr检测有目的条带的线、如果是做表达载体构建,pcr产物和质粒DNA酶切后与没有酶切的在同一块胶上电泳,如果两个酶切位点很近,几乎看不到被切下来的小片段条带(太小,早就跑出去了)。你要是怕酶切不完全就多稍微加点酶,切的时间长一点。

  4、关于酶切产物有几条带视酶切效果而定,酶切完全则两条,一大一小(小的可能看不到,原因见3、)酶切不完全则三条带,一大一小及未切开的pcr产物;质粒的话可能还多一条环状分子和线状分子的区别。

  我要做通过质粒携带目的基因转化以提高宿主菌的酶活,这只做连接表达载体吗,要不要先经过连接T载体后酶切再连接表达载体?最好是先连接T载体测序后确定是你的目的基因再做表达载体的连接,这样保险一点。也可以酶切后直接连表达载体。

  你是不是要把双酶切后的质粒与载体连接,而无论是PCR还是载体都无法通过电泳判断是否酶切完全,所以不好进行连接呀?对于PCR产物一般会采取这样的策略,将产物首先连接到T载体上,然后再用设计好的双酶切,电泳回收切下的条带,这样就能确保得到的是完全酶切的产物。载体判断比较麻烦,要看载体本身、多大双酶切为点之间的条带有多大、双切前后的大小是否能通过电泳区别出来,但是双切位点一般都在标记基因里面,所以插入片段的载体会在后期转化可以后区分开,所以也没有太大必要确定他是否完全,只要充分酶切就好了。对的,不用酶切,直接连接T载体,送去测序证明得到的片段没有碱基突变之后再酶切克隆到相应的载体上去,这是最有保证的做法

  展开全部这个一般酶切一到两个小时就结束。再去电泳分离,将你要的片段(根据理论大小)切胶回收。因而你不用去判断是否酶切完成或者完全酶切开了(只要90%或者以上的都切开就行了)。如果你非要百分之百的切开,可能电泳也难以检测。而且意义不大。

  如果你想节省内切酶,也可以切过夜。不过如果你的质粒提的质量不高,可能让质粒降解。一般两个小时足够了。

  展开全部PCR产物酶切后不能判断是否完全..质粒如果切下来的片断不是很小,可以取少量进行电泳查看条带..如果没有完全酶切,大条带会出现单酶切的产物条带.

  追问目的基因与载体连接不是要酶切完全后连接吗,怎么判断啊追答实际操作中不可能全部完全的,只要有大部分酶切完全了,就可以了.因为后面还有筛选,提质粒,测序等方法可以鉴定..